Diagnosis botulisme adalah berdasarkan pengenalan toksin Clostridium botulinum di makmal dan pemerhatian terhadap gejala klinikal, walaupun kadang-kadang tidak spesifik. Penyakit ini, sebenarnya, boleh dikelirukan dengan sindrom Guillain-Barré, poliomielitis, strok, myasthenia gravis dan kelumpuhan pemeriksaan.
Dalam botulisme makanan, gambaran gangguan neuromuskular dan pengambilan makanan yang berpotensi tercemar adalah petunjuk penting. Manifestasi serentak dalam sekurang-kurangnya 2 pesakit yang makan makanan yang sama memudahkan diagnosis. Pengesahan diperolehi dengan mengasingkan mikroorganisma dengan ujian kultur suspek sampel makanan atau najis pesakit dan dengan pengenalan toksin botulinum dalam makanan atau bahan biologi (seperti darah, jus gastrik dan muntah).
Di dalam botulisme luka, di sisi lain, diagnosis serum toksin atau pengasingan Clostridium botulinum dari sampel lesi kulit mengesahkan ini.
